抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义-久久健康网

抗中性粒细胞胞浆抗体在系统性红斑狼疮中的临床意义

中华皮肤科杂志1999年第1期第32卷论著

作者：罗婷赵明辉马圣清

单位：罗婷、马圣清(100034北京医科大学第一医院皮肤科)；赵明辉(肾脏内科)

关键词：红斑狼疮；系统性；抗中性粒细胞胞浆抗体

【摘要】目的为了探讨抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在系统性红斑狼疮(SLE)中的临床意义。方法通过间接免疫荧光(IIF)、酶联免疫吸附试验和免疫印迹方法检测了84份SLE患者血清ANCA的阳性率和6种已知的靶抗原：蛋白酶3、髓过氧化物酶、杀菌－通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶G和乳铁蛋白。结果间接免疫荧光法检测ANCA在SLE中的阳性率是22.6％，均为核周型ANCA；分别有44.1％和14.3％的SLE患者血清含有抗组蛋白酶G和乳铁蛋白自身抗体，且活动期的阳性率明显高于稳定期。结论组蛋白酶G为ANCA的主要靶抗原，且抗组蛋白酶G抗体与SLE的病情活动有关。

AntineutrophilCytoplasmicAntibodiesandTheirTargetAntigensinPatientswithSystemicLupusErythematosus

LUOTing,ZHAOMinghui,MAShengqing.departmentofDermatology,FirstTeachingHospital,BeijingMedicalUniversity,beijing100034

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheclinicalsignificanceofantineutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)andtheirtargetantigensinsystemiclupuserythematosus(SLE).Methods84serumsampleswerecollected,andindirectimmunofluorescence(IIF)andELISAwereusedtodetectthepositiveratesofANCAand6knowntargetantigen,the6specificANCAantigensincludedproteinase3(PR3),myeloperoxidase(MPO),bactericidal/permeability-increasingprotein(BPI),humanleukocyteelastase(HLE),cathepsinG(CG)andlactoferrin(LF).PositiveserawerefurthurstudiedbyWesternblotanalysis.ThepositiverateofANCAwasalsocomparedbetweenpatientswith(n=50)andwithout(n=34)lupusactivitiestorevealwhetherANCAwerecorrelatedwithlupusactivities.Results22.6％serashowedANCApositivebyIIFmethod,andallofthemwereperipheralnuclearaNCA.However,ELISAtestingshowedthat44.1％and14.3％serarecognizedCGandLF,respectively.Thepositiveratesofanti-CG,andanti-LFantibodiesinpatientswithactivelupusweresignificantlyhigherthanthoseinnon-activepatients(P＜0.001).ConclusionThetargetantigenofANCAinSLEpatientswasCG,andanti-CGantibodiesmightbecorrelatedwithlupusactivities.

【Keywords】Lupuserythematosus,systemicAntineutrophilcytoplasmicantibodies

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体。有研究报道在系统性红斑狼疮(SLE)中ANCA有一定的阳性率，但是文献中对靶抗原的报道并不一致，对ANCA在SLE中的临床意义也有争议[1，2]。为此，我们检测了84份SLE患者血清中6种已知的ANCA靶抗原和阳性率，并且初步探讨了ANCA在SLE中的临床意义。

材料和方法

一、临床资料

84份SLE患者血清采自1992年1月至1997年8月我科就诊的患者。所有病例均符合美国风湿病协会制定的诊断标准。根据Urowitz等提出的狼疮活动性标准[3]分为活动期和稳定期，其中活动期血清50份，稳定期血清34份。58份正常人血清为对照。

二、实验方法

1.间接免疫荧光法(IIF)：从正常人静脉抗凝血中分离白细胞为底物进行IIF检测[4]。制备底物的方法简述如下：健康人肝素抗凝血10mL，加预冷的4倍红细胞溶解液(0.83％nH4Cl10mmol/LKHCO30.1mmol/LEDTA)。置冰盒10min后离心1500r/min，10min，弃上清液，收集底部细胞层。0.01mol/LpBS洗2次后，置含5％胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞浓度为106/mL。细胞离心机(Shadon)甩片，纯酒精(4℃预冷)固定5min，－20℃保存备用。IIF结果判定中性粒细胞胞浆内呈亮绿色荧光，在细胞核核叶之间有重染者为胞浆型ANCA(c-ANCA)；荧光着色环绕细胞核周围则为核周型ANCA(p-ANCA)。

2.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ANCA：参照Wiik[4]。6种特异性抗原：蛋白酶3、髓过氧化物酶、杀菌－通透性增高蛋白、弹力蛋白酶、组蛋白酶G和乳铁蛋白分别用0.05mol/L碳酸盐(pH9.6)缓冲液(BPI则用0.01mol/LpBS缓冲液)稀释后包被酶标板，终浓度为1～2μg/mL。χ2检验比较SLE活动期与稳定期两组患者ANCA的阳性率。

3.免疫印迹法测定ANCA：1中性粒细胞粗抗原的制备：参照文献[4]。取健康人的肝素抗凝血200ml，加预冷的4倍红细胞溶解液；4℃，10min后离心，1500r/min,10min，弃上清液。底部沉淀打匀后，重复上述步骤一次。预冷的PBS缓冲液清洗2次。加0.2mol/L醋酸钠(pH4.2)10mL,PMSF(Sigma)终浓度1mmol/mL。超声细胞粉碎机粉碎细胞(共10次，每次30s，中间间隔30s，冰浴中进行)；4℃，12000r/min，离心20min；测上清液中的蛋白浓度；将上清液分装入Ependorf管，冷冻干燥，－20℃保存备用。2免疫印迹法：参照文献[5]。

结果

1.IIF法：84份SLE患者血清，19份阳性，均为p-ANCA，阳性率22.6％。

2.ELISA法：84份SLE血清中无1例识别蛋白酶3、髓过氧化物酶或杀菌－通透性增高蛋白，只有2份识别弹力蛋白，12份识别乳铁蛋白(14.3％)，37份识别组蛋白酶G(44.0％)。50份活动期血清中，10份乳铁蛋白阳性(20.0％)，29份组蛋白酶G阳性(58.0％)；而34份稳定期血清分别只有2份乳铁蛋白阳性(5.9％)，8份组蛋白酶G阳性(23.5％)，经χ2检验，两者具有显著性的差异(P＜0.01)。

3.免疫印迹法：阳性血清相对分子质量为29000、78000的蛋白条带，分别是特异性抗原组蛋白酶G和乳铁蛋白。

讨论

ANCA是近10年来国际上血管炎研究领域的一大热点。研究表明，不同的ANCA类型和靶抗原往往与临床上不同的疾病相关[6]。虽然有研究报道SLE中ANCA有一定的阳性率，但是对靶抗原和其中的临床意义存在争议[1，2]。通常用IIF法检测ANCA分为两种类型：胞浆型ANCA，其靶抗原主要是PR3，还有一部分是BPI；核周型ANCA，其靶抗原主要是髓过氧化物酶，还有组蛋白酶G、弹力蛋白酶和乳铁蛋白等。

近年来，有关ANCA在SLE中的研究涉及了检测方法、特异性靶抗原、临床意义等各个方面。由于SLE中ANA的阳性率很高，与p-ANCA很难区别。应注意选用淋巴细胞为底物作内参照。ANA不仅可识别外周血单一核细胞，也识别淋巴细胞，而p-ANCA不识别淋巴细胞内的成分。但是，当ANA和ANCA同时阳性时，ANA的荧光很强可掩盖ANCA，与p-ANCA区分很困难。本研究中IIF法的阳性率仅为22.6％，明显低于ELISA法。因此应用IIF法检测SLE患者的ANCA仅可作为过筛，要通过ELISA法明确靶抗原。

本研究检测了ANCA的6种已知抗原，84份SLE血清无1例识别髓过氧化物酶、杀菌－通透性增高蛋白，只有2例弹力蛋白酶阳性，有12例乳铁蛋白阳性(14.3％)，37例组蛋白酶G阳性(44.0％)，说明SLE中ANCA的靶抗原主要是组蛋白酶G和乳铁蛋白。并且活动期组蛋白酶G和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期。本组资料未发现ANCA阳性与重要器官如肾脏受累有关；患者病程中出现皮肤血管炎改变与ANCA阳性也无明显关系。本组资料表明，IIF法检测SLE患者血清中p-ANCA的阳性率是22.6％，未见c-ANCA；特异性靶抗原主要是组蛋白酶G和乳铁蛋白，组蛋白酶G的阳性率可达到44.0％。我们进一步发现SLE病情活动期组蛋白酶G和乳铁蛋白的阳性率明显高于稳定期，提示抗组蛋白酶G和乳铁蛋白自身抗体可能与SLE的病情活动有关。

参考文献

[1]SpronkPE,BootsmaH,HorstG,etal.antineutrophilcytoplasmicantibodiesinsystemiclupuserythematosus.BrJrheumatol,1996,35:625-631.

[2]SchnabelA,CsernokE,IsenbergDA,etal.Antineutrophilcytoplasmicantibodiesinsystemiclupuserythematosus:prevalence,speceficities,andclinicalsignificance.ArthritisRheum,1995,38:633-637.

[3]蒋明,朱立平,林孝义主编.风湿病学.第1版.北京:科学出版社,1995.1037.

[4]WiikA,RasmussenN,WieslanderJ.Methodstodetectautoantibodiestoneutrophilicgranulocytes.ManualBiolMarkersDis,1993;A9:1-14.

[5]ZhaoMH,JonesSJ,LockwoodCM.Bactericidal/permeability-increasingprotein(BPI)isanimportantantigenforanti-neutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)invasculitis.ClinExpImmunol,1995,99:49-56.

[6]GrossWL,CsernokE,HelmchenU.Antineutrophilcytoplasmicautoantibodies,autoantigen,andsystemicvasculitis(Review).APMIS,1995,103:81-97.

(收稿：1998－03－13修回：1998－08－20)

（责任编辑：zxwq）

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