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系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞bcl-2的表达及临床意义

中华皮肤科杂志1999年第1期第32卷论著

作者：刘亚光尹培达石成钢赵湘茹孔庆瑜黄必军

单位：刘亚光、尹培达、石成钢、孔庆瑜(510080广州，中山医科大学附属第一医院风湿科)；赵湘茹(教学实验中心)；黄必军(肿瘤研究所)

关键词：红斑狼疮；系统性；细胞死亡；Bcl-2

【摘要】目的为了探讨bcl-2基因在系统性红斑狼疮(SLE)发病机制中的作用及临床意义。方法应用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测31例SLE患者外周血单一核细胞(PBMC)bcl-2mRNA表达水平和流式细胞仪双标记法分析其T、B细胞bcl-2蛋白表达。结果活动期SLE患者PBMCbcl-2mRNA表达水平明显升高，占55.6％，且活动期SLE患者CD3＋、CD4＋和CD8＋T细胞亚群bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE患者、正常人对照组和其他疾病组，而CD19＋B细胞bcl-2蛋白表达在各组之间并无统计学差异。结论T细胞bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用，检测SLE患者外周血T淋巴细胞bcl-2的表达水平可作为SLE的活动性指标。

Expressionofbcl-2inLymphocytesfromPatientswithSystemicLupusErythematosusandItsClinicalSignificance

LIUYaguang,YINPeida,SHIChenggang,etal.DivisionofRheumatology,KidneyInstitute,FirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversityofMedicalSciences,Guangzhou510080

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheroleofbcl-2expressioninthepathogenesisofsystemiclupuserythematosus(SLE)anditsclinicalsignificance.MethodsThebcl-2mRNAlevelsinperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)from31SLEpatientsweretestedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR),andthebcl-2proteinlevelsinTandBcellswerealsotestedbytwo-colourcytofluorography.Resultsbcl-2mRNAlevelsinPBMCincreasedsignificantlyin10casesofactiveSLE,accountingfor55.6％ofactiveSLEpatients.ComparedwiththoseininactiveSLEpatients,normalcontrolsandothernon-SLEpatients,thebcl-2proteinexpressioninTcellsubsets(includingCD3＋,CD4＋andCD8＋)increasedsignificantlyinactiveSLEpatients.However,therewasnostatisticaldifferenceinbcl-2proteinlevelsinCD19＋Bcellsamongallgroups.ConclusionTheabnormalexpressionofapoptosis-relatedbcl-2inTcellsmightplayanimportantroleindiseaseactivityofSLE,andthedeterminationofbcl-2expressionlevelsofperipheralTlymphocytesmightbeusedasanindexfordiseaseactivityofSLE.

【Keywords】Lupuserythematosus,systemicApoptosisBcl－2

bcl-2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂21.3(18q21.3)[1]。近年发现，bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因，bcl-2转基因鼠自身反应性B细胞克隆消除功能抑制，B细胞记忆和生存期均延长，可产生许多自身抗体，形成SLE样病损，因而有人称之为自身免疫基因[2]。为此，我们检测了SLE患者外周血单一核细胞(PBMC)bcl-2表达水平。

病例和方法

(一)对象：31例住院和门诊病例均符合1982年美国风湿病协会SLE分类修订标准。其中女26例，平均年龄31±8岁(18～58岁)。几乎所有患者在受检时均用过泼尼松10～30mg/d。参照唐福林等[3]标准按受检时临床及实验室检查结果分为活动期和非活动期，活动期18例，非活动期13例。设其他疾病组9例(类风湿关节炎和慢性肾炎各3例，强直性脊柱炎、多发性肌炎和白塞病各1例)。正常人对照组14例系健康人员，女10例，平均年龄33±9岁(21～59岁)。

(二)方法：

1.PBMC分离：采用分层液密度梯度离心获取PBMC。

2.PBMCbcl-2mRNA测定[4]：根据Chomczynski的一步法提取总RNA，以0.5％SDS于－80℃保存备用。以逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)测定bcl-2的mRNA表达水平。cDNA合成总体积为20μL：RNA模板2μL(2μg)，25mmol/LMgCl20.8μL，AMV缓冲液4μL，10mmol/LdNTP1μL，Oligo(dT)1.5μL，AMV-RTase1μL，DEPCH2O10.7μL，42℃孵育1h，95℃5min终止反应。参照文献[4]在加拿大真达生物技术公司合成引物，bcl-2正义引物=5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′，反义引物=5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3′；扩增产物范围318bp。内对照β-肌动蛋白正义引物=5′-GTGGGGCGCCCAGGCACCA-3′，反义引物=5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增产物范围548bp。按以下配方进行PCR，即cDNA模板5μL,10mmol/LdNTP5μL，10×缓冲液(100mmol/LTris/HClpH8.225mmol/LMgCl20.01％明胶)5μL,50pmol/L引物各1μL，TaqDNA聚合酶3U(1.5μL)(Promega)，补足双蒸水至总体积50μL，混匀。在PE9600型扩增仪上进行循环，95℃预变性5min后，加入Taq酶，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃充分延伸7min。产物4℃备用。取15μLPCR产物，作1.5％的琼脂糖凝胶电泳，以PBR322/BstNⅠ8μL作分子量标记，溴化乙锭染色并在紫外线透照仪上观察DNA电泳带结果。

3.T、B淋巴细胞bcl-2蛋白表达的检测[4，5]：以流式细胞仪双标记免疫荧光方法测定外周血T、B淋巴细胞bcl-2蛋白的表达。PBMC加入多聚甲醛使其终浓度为0.5％，4℃过夜后离心弃上清液，加入0.1％的Triton1005min离心弃上清液，每管分别加入FITC标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8和CD19单抗(IgG1)(Immunotech)10μL，再加入兔抗人bcl-2多抗(Dako)5μL，混合后4℃60min，PBS洗2遍，所有管都加入若丹明标记的羊抗兔IgG(Immunotech)5μL，混合后4℃60min，以流式细胞仪(Coulter)分析每管样品中10000个细胞得出表达bcl-2蛋白阳性的百分率。

(三)统计分析：应用美国SPSS6.0对实验数据进行Mann-WhitneyU检验。

结果

结果显示，活动期SLE患者PBMCbcl-2mRNA表达明显升高者10例，占55.6％，而非活动期SLE、其他疾病组和正常人对照组PBMCbcl-2mRNA表达水平未见明显增加。进一步分析发现，活动期SLE患者CD3＋、CD4＋和CD8＋T细胞亚群bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE、其他疾病组和正常人对照组(P＜0.01)，而CD19＋B细胞bcl-2蛋白的表达在SLE活动期与非活动期及正常人对照组、其他疾病组之间无统计学差异(P＞0.05)。同时CD3＋、CD4＋和CD8＋T细胞亚群bcl-2蛋白表达阳性率在非活动期SLE、其他疾病组和正常人对照组之间也无显著性差异(P＞0.05)(见表1)。

表1SLE患者T细胞亚群和B细胞bcl-2蛋白表达（±s%）

组别例数CD3CD4CD8CD19活动期SLE1863.49±16.7764.32±16.2960.76±16.9278.23±11.50非活动期SLE1314.52±10.9314.07±11.7015.93±11.5680.56±10.48其他疾病组911.47±4.9712.44±5.7711.00±4.9878.59±7.52正常人对照组149.94±4.9614.99±20.9210.53±4.8981.91±6.97讨论

SLE是一种全身性多器官的自身免疫病，免疫学特征是B细胞多克隆化，T细胞活化增加，产生许多自身抗体。其发病机制尚不清楚。有人报道活动期SLE患者T细胞bcl-2蛋白表达明显增高[5，6]，且PBMCbcl-2mRNA表达水平明显升高[7]，我们也证实活动期SLE患者T细胞bcl-2蛋白和PBMCbcl-2mRNA表达均显著增加，与非活动期SLE患者有显著性差异。Strasser等[8]观察到细胞凋亡抑制基因bcl-2对成熟T细胞具有明显效应，可表达bcl-2的外周血T细胞在培养中不仅生存较长，而且也产生持续时间长而剧烈的抗原反应。这种抗原反应的变化可能是活化T细胞凋亡被抑制的结果。另外，我们发现CD4＋T细胞(T辅助细胞)和CD8＋T细胞(T抑制细胞)亚群bcl-2表达异常，这可导致T细胞亚群凋亡的异常，从而引起SLE患者T细胞的免疫调节功能紊乱，而SLE患者B细胞的活化是T细胞依赖性的，在B细胞多克隆化过程中，T细胞调节功能紊乱是一个重要因素。表明T细胞bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用，检测SLE患者血T淋巴细胞bcl-2的表达水平可作为SLE的活动性指标。

国家自然科学基金资助(39770706)

参考文献

[1]TsujimotoT,FingerLR,YunisJ,etal.CloningthechromosomebreakpointofneoplasticB-cellswiththet(14;18)chromosometranslocation.Science,1984,226:1097-1099.

[2]TalalN.Concludingremarks:autogenesandoncogenes.ClinImmunolImmunopathol,1994,72:208-209.

[3]唐福林,董怡,陈培珍,等.系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎病人血清中抗组蛋白抗体的测定及其临床意义.中华内科杂志,1990,29:221-223.

[4]TuY,XuF,LiuJ,etal.Upregulatedexpressionofbcl-2inmultiplemyelomacellsinducedbyexposuretodoxorubincin,etoposide,andhydrogenperoxide.Blood,1996,88:1805-1812.

[5]OhsakoS,HaraM,HarigaiM,etal.Expressionandfunctionoffasantigenandbcl-2inhumansystemiclupuserythematosuslymphocytes.ClinImmunolImmunopathol,1994,73:109-114.

[6]AringerM,WintersbergerW,SteinerCW,etal.Highlevelsofbcl-2proteinincirculatingTlymphocytes,butnotBlymphocytes,ofpatientswithsystemiclupuserythematosus.ArthritisRheum,1994,37:1423-1430.

[7]GraningerWB.Transcriptionaloverexpressionoftheprotooncogenebcl-2inpatientswithsystemiclupuserythematosus.WienWlinWochenschr,1992,104:205-207.

[8]StrasserA,HarrisAW,CorySB.bcl-2transgeneinhibitsTcelldeathandperturbsthymicself-censorship.Cell,1991,67:889-899.

(收稿：1997－10－16修回：1998－05－11）

（责任编辑：zxwq）

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